1882 年的 3 月 24 日伟大的微生物学家罗伯特·科霍发现了结核病的致病元凶-结核分枝杆菌，为了纪念这一发现，世界卫生组织于 1995 年年底将每年的 3 月 24 日定为「世界防治结核病日」。
今年的「世界防治结核病日」主题为「联合起来消除结核病」，在「联合起来消除结核病」主题下倡议有四个分主题，其中第二个分主题为「我们共同努力可以更好地检测、治疗和治愈结核病」。这个分主题中的检测和我们检验息息相关，今天就和大家共同学习一下结核病的实验室检测。
病原学检测
1. 痰涂片镜检：通常留取痰标本三份（即时痰、夜间痰和清晨痰），通过特殊的抗酸染色或荧光染色方法染色后，用显微镜进行观察。最常用的是萋-尼氏抗酸染色，结核分支杆菌被染为红色，通过普通光学显微镜的高倍镜进行观察，结果以阴阳性报告，具体如下：
抗酸杆菌阴性（－）：连续观察 300 个不同视野，未发现抗酸杆菌。
抗酸杆菌阳性：
—报告抗酸杆菌菌数：1～8 条/300 视野。
—抗酸杆菌阳性（1＋）：3～9 条/100 视野。
—抗酸杆菌阳性（2＋）：1～9 条/10 视野。
—抗酸杆菌阳性（3＋）：1～9 条/每视野。
—抗酸杆菌阳性（4＋）：≥ 10 条/每视野。
痰涂片的方法简单快速，对设备的要求低，但灵敏度较差，一般 1 mL 痰中分支杆菌达到 5000~10000 条时才能检出，对于菌含量低病人、肺外结核感染病人及无痰的儿童患者检出率较低。
2. 结核分支杆菌培养：培养是微生物检测的金标准，也是获得菌株进行下一步药敏试验的前提。根据培养基的不同，可以分为固体培养和液体培养：液体培养是通过添加了生长刺激剂，提高检测灵敏度，缩短阳性报告时间，但因其价格昂贵且容易污染，目前并未广泛应用。固体培养最常用的是固体罗氏培养法，其结果以阴阳性报告，具体如下：
分枝杆菌培养阴性：培养 8 周未见菌落生长者
分枝杆菌培养阳性：
—分枝杆菌培养阳性（1+）：培养基斜面菌落分散生长，占据斜面面积的 1/4 以下者。
—分枝杆菌培养阳性（2+）：培养基斜面菌落分散生长，占据斜面面积的 1/2 以下者。
—分枝杆菌培养阳性（3+）：培养基斜面菌落密集生长或部分融合，占据斜面面积的 3/4 以下者。
—分枝杆菌培养阳性（4+）：培养基斜面菌落密集生长呈苔样分布，占据全斜面者。
虽然培养法特异性好，是诊断结核菌病的金标准，但其耗时较长，一般需要 4 到 8 周时间。
免疫学检测
1. 抗结核抗体检查：通过特异性较强的结核菌体成分作为检测抗原检测血清中的抗结核抗体对结核菌病进行辅助诊断，是一种快速、简单、有较好特异性和敏感性，对抗酸染色阴性及不容易取得细菌学检查标本的肺外结核病、儿童结核病有较高的诊断价值。根据检测方法的不同有：凝集试验、酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫斑点法、免疫胶体金法等。
2. 结核菌素试验：凡感染过结核菌的机体会产生相应的致敏淋巴细胞，具有对结核杆菌的识别能力，当再次遇到通过皮肤注射的结核菌纯蛋白衍生物（PPD）
时，产生局部的炎症反应，出现红肿硬结。结核菌素试验 72 h（48 h～96 h）检查反应，以局部皮下硬结为准：
阴性：硬结平均直径＜5 mm 或无反应者为阴性。
硬结平均直径 5 mm～9 mm 为一般阳性。
硬结平均直径 10 mm～19 mm 为中度阳性。
硬结平均直径 ≥ 20 mm（儿童 ≥ 15 mm）或局部出现水泡、坏死及淋巴管炎者为强阳性。
结核菌素试验对活动性结核的诊断灵敏度可达将近 80%，但免疫力低下患者会出现假阴性，而且不能区分结核菌感染还是卡介苗接种。
3. γ干扰素释放试验：结核杆菌感染后体内长期存在致敏的 T 淋巴细胞（包括 CD4+和 CD8+T 淋巴细胞），当再次遇到抗原刺激时可用迅速活化释放γ干扰素，通过检测释放的γ干扰素可以确定患者体内是否存在被结核杆菌致敏的 T 淋巴细胞。阳性患者可能是活动性结核病患者、既往感染者或潜伏感染者。最常用的检测方法是酶联免疫斑点试验，即 T-SPOT.TB。
分子生物学检测
1. 核酸扩增技术：包括传统的 PCR 和实时定量 PCR，与传统实验室检测方法相比，核酸扩增技术快速，特异性高，而且可以区分结核分支杆菌与非结核分支杆菌。对于痰涂片阳性标本，可以快速区分是结核分支杆菌感染还是非结核分枝杆菌感染。
2. 线性探针检测：将 PCR 扩增与核酸杂交相结合的一种技术，首先通过 PCR 扩增基因的耐药决定区域，然后将标记的 PCR 产物与固定在纸条上的探针杂交，显现出肉眼可见的条带，对利福平和异烟肼耐药检测具有高度的敏感性和特异性。
3. 环介导等温扩增技术：采用 2 对引物在等温条件下即可完成 DNA 的扩增，扩增结果通过肉眼观察荧光进行判定，诊断是否为结核病。同时整个反应体系采用封闭系统减少了工作区域扩增子的污染，整个反应过程只需一个小时即可完成。但该方法对涂片阳性标本有较高的敏感性，对涂片阴性标本敏感性较低。
4. 基因芯片： 基因芯片可以同时检测多个基因序列，可以同时对多种分支杆菌进行检测。另外，基因芯片也可用于耐药结核分支杆菌的检测。
本文作者：丁香园论坛检验版版主 xxll2006
