肿瘤转移是一个多阶段、多步骤的复杂过程。存在于原发瘤和转移瘤之外的肿瘤细胞统称为游离肿瘤细胞，其中进入血流的又称循环肿瘤细胞circulating tumor cell，CTC）。Ashworth首次报道在患者外周血中发现类似肿瘤的细胞，并提出CTC的概念。1991年，Smith等首先应用反转录聚合酶链反应（reverse-transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）检测实体肿瘤患者外周血中的肿瘤细胞。近年来，敏感分子技术的发展使得分离、计数外周血CTC成为可能。CTC在外周血中的数量稀少，大约每l05～107个单核细胞中才有一个CTC。现有针对CTC的检测技术大致分为细胞富集技术和分析技术两类。
1 细胞筛选富集技术
由于外周血中CTC的数量非常少，对血液样本中的目标细胞进行富集以提高其检出率，显得极为重要。常见的细胞筛选富集技术如下。
1.1免疫磁性分选技术
免疫磁性分选技术（immunomagnetic separation，IMS）采用纳米微粒制备成免疫磁珠，磁珠上的特异性抗体与靶细胞上的抗原结合成靶细胞-抗原抗体-磁珠复合物，其在磁力作用下发生移动，进而与别的物质分离，达到分离特异性细胞的目的。美国Veridex公司研发的CellSearch是目前美国食品和药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）惟一批准的CTC检测方法。其基本步骤为：上皮细胞黏附因子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）抗体磁珠用于捕获CTC，细胞角蛋白（cytokeratin，CK）荧光抗体识别上皮细胞、CD45抗体识别白细胞、4'6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）荧光核染料用于生成细胞图像。符合肿瘤细胞学形态特征并且CK-PE+、DAPI+和CD45-细胞被定义为CTC。该检测可自动分选从上皮性肿瘤脱落后进入血液中的肿瘤细胞.只需要7.5ml血液样本，即可从400多亿血细胞中检测到一个CTC。磁性细胞分选技术的策略包括阳性筛选、阴性筛选以及两种方法的结合。已有报道，其富集效率与一般的分离方法相比可提高103～104倍。但该方法在缺乏细胞表面标志物的非上皮起源实体瘤（如肉瘤）细胞的应用受到限制，并且其在富集过程中可能存在CTC丢失的风险。
1.2 膜滤过法
Vona等建立了膜滤过法用于分离和计数CTC，该方法也称为上皮肿瘤细胞大小分离法（isolation by size of epithelial tumor cell，ISET）。上皮肿瘤细胞比外周血细胞大，过滤可使上皮肿瘤细胞得到分离，这种方法简单、经济。由于是借助细胞的物理特性进行细胞分离，因此筛选不具特异性，应用受到一定限制。
1.3 密度梯度离心法
密度梯度离心法（density gradient centrifugation）利用不同种类细胞密度差异，通过离心使其分层达到提取肿瘤细胞的目的，为实验室常用的收集肿瘤细胞的方法之一，但该方法同样是借助细胞的物理特性进行细胞分离，缺乏特异性，易导致缺乏相应密度的肿瘤细胞丢失。
2 分析技术
2.1 免疫细胞化学法
免疫细胞化学法是指以显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和细胞化学的呈色反应，对相应抗原进行定位、定性和定量测定的技术。其综合了免疫反应的特异性、组织化学的可见性，从而具有较高的使用价值，但其检测敏感性低，只能从1×105～1×106个正常细胞中发现1个肿瘤细胞，且应用免疫细胞化学法检测CTC时，每个载玻片上所能检测的细胞样本量仅为5×105个细胞。同时该检测方法具有一定的主观性。使其应用受到了一定程度的限制。
2.2 流式细胞术
流式细胞术是一项集激光、电子物理、光电测量、计算机、细胞荧光化学、单克隆抗体技术为一体的技术。具有准确、快速的优点。但其检测靶细胞的敏感度较低，通过与其他细胞富集技术（如磁珠富集）联用可对CTC进行特异性富集，提高方法的敏感性和鉴别力，增加检出率。
2.3 RT-PCR
以肿瘤和上皮组织中某种物质的mRNA为标志物检测CTC。RT-PCR的敏感性和特异性都很高，目前已可在107～108个外周血单个核细胞中检测出单个肿瘤细胞。由于肿瘤细胞内一个基因mRNA的拷贝数量在细胞周期中是不断变化的，而且还存在去分化现象，使得标准PCR的阳性率与实时定量PCR检测的标志物水平可能受到影响，加大区别肿瘤细胞数量与mRNA表达水平之间变化的难度。鉴于方法的高度敏感性，易产生假阳性结果。这也是不得不考虑改进的一个因素。
3 CTC检测芯片
CTC检测芯片技术是近年发展起来的一种新技术，具有较高的敏感性，同时可以较好地保留CTC的体外活性。在一个标准载玻片上分布有大约78000个涂布EpCAM抗体的微阵列柱，经过乙二胺四乙酸（EDTA）处理过的外周血样品通过摇动装置混匀后被气压泵输入芯片，使其经过芯片表面和微阵列柱之间，以最大程度地捕捉肿瘤细胞。在通过抗CK、CD45抗体和DAPI免疫荧光标记后，只有CK+、CD45-和DAPI+细胞才被认为是CTC，可对其进行原位定性及定量检测。CTC检测芯片技术在非小细胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌中都有广泛应用。大概每毫升血液能检测到的CTC 79～196个。尽管与CellSearch系统相比其敏感性相对较高，但其目前主要用于研究用途，还没有相关可靠实验证实其临床意义。最近有一种更精练的方法称为V型芯片（herringbone-chip），提供了一个更强的CTC分离平台。基于CTC芯片技术，将微流体装置平坦的上部更改为V型，打破细胞的层流状态，增加其微小的涡流，进而增加其与涂布有EpCAM抗体的微阵列柱接触的机会，从而提高检出效率。
4 CTC检测与肺癌
Tanaka等报道入组150例患者，非肿瘤性疾病25例，原发性肺癌125例，其中伴有远处转移3l例。CTC在肿瘤性患者中的检出率为30.6%，非肿瘤性患者中为12.0%。肺癌患者CTC显著高于非肿瘤疾病患者，但二者CTC的检出效率欠佳（P=0.122）。在肺癌患者中CTC计数高者疾病进展率尤其是远处转移率增加，提示CTC检出可能与患者疾病复发及预后有关系。Yamamoto等用RT-PCR检测了99例非小细胞肺癌患者外周血中表面活性蛋白（SP）-A、-C的表达，结果显示检测阳性率分别为33.3%（33/99）、14.1%（14/99），SP-A、-CmRNA表达与临床分期、是否远处转移相关。Bevilacqua等首次使用CelISearch技术在小细胞肺癌患者外周血中发现EpCAM+CK+CTC，为指导小细胞肺癌的治疗提供了可靠的依据。同时，Hou等检测50例小细胞肺癌患者CTC为O～44896个/7.5ml血，中位CTC检测值为28，单变量分析CTC检测数值较高患者（＞300个）较CTC较低患者（＜2个）预后差（4.5个月：14.8个月，P＜0.005），在1个化疗周期后CTC持续提高对于总生存是一个强烈的预后因子。
5 结语
关于CTC在肺癌中预后作用的研究仍在进行中，目前对于CTC检测的临床意义仍有诸多分歧，检测方法仍有不少需要改进的地方。相信随着分子生物学、物理学、免疫组织化学、基因工程学的进步，外周血CTC检测在肺癌的诊断、治疗及预后的应用会日益广泛。
